Nová terapeutická perspektiva: diferenciační faktory kmenových buněk

Nová terapeutická perspektiva: diferenciační faktory kmenových buněk

Hledání nových možností léčby představuje velmi dynamický obor onkologického výzkumu. Jednou z perspektivních oblastí, jež se rozvíjí v posledních letech, je zkoumání funkce a terapeutického využití diferenciačních faktorů kmenových buněk. Touto problematikou se zabývá i prof. Pier Mario Biava z Vědeckého ústavu IRCCS MultiMedica v Miláně (viz též informační video zde), který v Praze prezentoval přehled výsledků výzkumu v této oblasti.1

Diferenciační faktory kmenových buněk

Prof. Biava uvedl základní fakta o výzkumu diferenciačních faktorů kmenových buněk. Od 70. let 20. století je známo, že embryonální prostředí dokáže v průběhu diferenciačnich procesů působit proti onkogenezi.2,3 Kancerogenní látky vedou u plodu během organogeneze k vývoji malformací, ale nikoli k tvorbě nádorů. Jakmile je však organogeneze dokončena, vede aplikace kancerogenů do plodu ke zvýšení výskytu nádorů a k poklesu výskytu malformací.4,5 Bylo prokázáno, že implantace buněk melanomu do embryí ryby Danio rerio (Danio pruhované) nevede k vzniku tumoru, ale pokud se tyto buňky implantují dospělým jedincům této ryby, objeví se u nich tumory. Kromě toho buňky melanomu, vpravené do extraembryonální membrány Dania, se proměnily ve vlastní neurony, což ukazuje, že po implantaci do embrya se mohou nádorové buňky diferencovat do normálních.6

Z těchto zjištění vyplývá předpoklad, že faktory embryonálního mikroprostředí mohou kontrolovat průběh diferenciace buněk. Nejde však o jediný faktor, ale spíše jejich síť, která je zodpovědná za genovou expresi, vedoucí ke kompletní diferenciaci totipotentních kmenových buněk (tedy buněk, které obsahují kompletní genetickou informaci pro celý organismus a mohou se diferencovat v buňky kterékoli tkáně/orgánu). Biologické sítě jsou komplexní, jsou schopny samy sebe organizovat, opravovat a vytvářet řád. Onkologická onemocnění vznikají následkem různorodých změn, např. aktivací onkogenů, represí nebo mutací antionkogenů, produkcí růstových faktorů. Byla formulována koncepce, že k ovlivnění takto vznikého komplexního patogenního procesu je vhodné využít specifických regulačních sítí faktorů embryonálního mikroprostředí.

V posledních desetiletích bylo prokázáno, že malignita nádorového onemocnění souvisí mj. s přítomností maligních kmenových buněk v tumoru.7 Toto zjištění vytváří racionální základ pro využití diferenciačních faktorů kmenových buněk v léčbě onkologických onemocnění. Na základě těchto zjištění byl formulován koncept, že nádorová buňka je vlastně kmenová buňka zablokovaná v multiplikační fázi, neschopná dokončit svou diferenciaci. Podobnost nádorových a kmenových buněk je v řadě vlastností: obsahujíonkofetální antigeny, specifické receptory pro diferenciační faktory, společné signální dráhy, je pro ně charakteristický anaerobní metabolizmus. Zásadní roli hrají diferenciační faktory kmenových buněk. Jsou to druhově spíše nespecifické proteiny, jejichž účinek je závislý na vývojovém stadiu embrya.

Vliv diferenciačních faktorů na nádorové buňky

Prof. Biava v další části přednášky prezentoval výsledky testů in vitro, při kterých bylo působeno embryonálními extrakty z různých stádií vývoje embrya Dánia pruhovaného na různé typy nádorových buněk (glioblastomu, melanomu, karcinomu mammy, lymfoblastické leukémie, adenokarcinomu ledvin). Šlo o čtyři různá vývojová stádia embrya: stadium moruly, tvořené totipotentnimi embryonálními kmenovými buňkami (multiplikační stadium); a dále tři diferenciační stádia (střední stadium blastuly-gastruly, ve kterém se totipotentní kmenové buňky diferencuíi na pluripotentní; stadium 5 somitů a stadium 20 somitů, ve kterém se odehrávají střední a závěrečné diferenciační fáze). Jako kontrola byly použity stejné typy nádorových buněk, ale bez ošetření uvedenými embryonálními extrakty. Výsledky ukázaly, že extrakty z embryí v diferenciačních stádiích vývoje snižovaly (oproti kontrole) rychlost proliferace všech typů nádorových buněk (v rozmezí od 26 % u melanomu do 73 % u glioblastomu). Extrakt získaný z embrya ve stadiu moruly (multiplikační stadium) proliferaci nádorových buněk ovlivňoval jen velmi slabě. Podle prof. Biavy tyto testy ukázaly, že v průběhu diferenciačních stadií jsou v embryu přítomny faktory, schopné přesměrovat nádorovou buňku na normální vývojovou dráhu, případně způsobit apoptózu nádorové buňky. Tyto faktory se objevuji od raných fází gastrulace, ale ve stadiu čistě multiplikačním ještě nejsou přítomny.8

Mechanismy působení DFKB a role proteinu p53

V rámci výzkumu těchto souvislostí bylo pátráno po mechanismech, kterými diferenciační faktory kmenových buněk (DFKB) působí tyto změny ve vývoji nádorových buněk. Ukázalo se, že vlivem těchto faktorů dochází k expresi důležitých molekul zapojených do regulace buněčného cyklu (např. proteinu p53 čiretinoblastomového tumor supresorového proteinu pRb). Ty působí prostřednictvím transkripčních a posttranslačních regulačnich procesů, kterými aktivují procesy vedoucí k apoptóze. Například při ošetření buněk multiformního glioblastomu a melanomu těmito faktory (DFKB) nastává blokáda fáze G1-S buněčného cyklu následkem významného zvýšení koncentrace tumor supresorového proteinu p53.9 Mezi molekulární mechanismy vytvářející základ pro zpomalení růstu nádorů po působení DFKB patří zastaveni buněčného cyklu ve fázi G1-S nebo G2-M (podle typu nádoru), opravení poškozené genetické informace a rediferenciace, anebo apoptóza nádorové buňky, pokud (z důvodu závažnosti mutačního poškození) reparace není možná.

Právě na příkladu proteinu p53 lze ukázat roli, kterou molekuly zapojené do regulace buněčného cyklu hrají v obraně proti nádorové transformaci buněk.Protein p53 je nukleární protein, k jehož důležitým úlohám patří ochrana buněk před nádorovou transformací. Je kódovaný genem TP53, kterému se přezdívá "strážce genomu", právě pro jeho klíčovou roli v regulaci genové exprese a patří mezi hlavní tumor-supresorové geny. Protein p53 patří mezi transkripční faktory a v buňce má funkci senzoru poškození DNA včetně suprese hrozící nádorové transformace. Při fyziologickém stavu buňky je protein p53 inaktivní a je navázán na přenašeč MD2. Při poškození DNA dojde k navození signalizační kaskády, jejímž výsledkem je fosforylace přenašeče MD2 a aktivace proteinu p53, která má za následek zastavení buněčného cyklu v G1 fázi, což zajistí buňce čas k reparaci. Pokud proběhne úspěšná oprava DNA, buňka může pokračovat v buněčném cyklu. Pokud je reparace neúspěšná, potom buňka navodí apoptózu. Syntéza p53 v buňce se zvyšuje, jakmile je buňka vystavena působení vlivů, poškozujících DNA. Protein p53 reguluje expresi řady genů, které mohou kontrolovat opravu DNA, růst buněk, apoptózu, angiogenezi. Význam genu kódujícího protein p53 dokládá i to, že je gen pro tento protein zmutovaný u téměř poloviny všech lidských maligních nádorů. Protein p53 může být inaktivovánonkogenem MDM2. Inaktivace proteinu p53 je důležitým krokem v nádorové transformaci mnoha typů buněk. Nejčastěji jí bývá nejčastěji dosaženo mutacemi v genu pro p53, ale i jinými cestami. Význam proteinu p53 lze doložit například i v souvislosti s protinádorovým působením vysokých, infuzně podaných dávek vitaminu C (askorbátu). Askorbát je důležitý antioxidant, považovaný za potenciální léčivo využitelné v onkologické terapii. Pro dosažení cytotoxicity, potřebné pro tento typ účinku, je zapotřebí dosažení farmakologických hladin, dosažitelných jen parenterálním podáním. Využívání askorbátu v onkologické klinické praxi je omezováno skutečností, že protinádorový účinek askorbátu je u různých buněčných linií rozdílný. Bylo poukázáno na to, že buněčná smrt způsobená askorbátem může mít různý mechanismus. Autoři studie publikované v roce 201210 ověřovali předpoklad, že protein p53 jako faktor, reagující na poškození DNA a regulující oxidativní stres v buňce, se významně podílí na cytotoxicitě askorbátu, který účinkuje také svým selektivním prooxidativním působením na některé linie nádorových buněk. Výsledky studie ukázaly, že přítomnost a koncentrace proteinu p53 v nádorových buňkách zvyšuje cytotoxicitu askorbátu tím, že zvyšuje produkci reaktivních sloučenin kyslíku prostřednictvím transkripční sítě proteinu p53. Cytotoxicita askorbátu byla vyšší u buněk u tumorů, jejichž buňky obsahují intaktní protein p53 než u p53-deficientních buněk. I tato zjištění potvrdila význam proteinu p53 v protinádorovém působení.

Klinické studie protinádorového působení DFKB

Po studiích na animálním modelu (např. u myší na modelu Lewisova plicního karcinomu, jehož růst byl po podávání regulačních faktorů kmenových buněk v průběhu 15 dnů sledování oproti kontrole významně zpomalen), proběhly i klinické studie účinnosti DFKB v onkologické léčbě. V roce 2005 byla publikována otevřená randomizovaná klinická studie, do které bylo zařazeno 179 pacientů se středně pokročilým až pokročilým hepatocelulárním karcinomem, u kterých nebyla již k dispozici žádná standardní léčebná možnost.11 Léčba pokročilého hepatocelulárního karcinomu (HCC) představuje terapeutický problém. Cílem této studie bylo zjistit účinnost léčby DFKB u pacientů, kteří nebyli schopni podstoupit radikální zákrok (resekci, transplantaci, ablační terapiii, arteriální chemoembolizaci). Ve studii byl užit přípravek s obsahem DFKB získané z embryí ryby Danio rerio. Přípravek byl podávánsublinguálně. Byla hodnocena reakce tumoru, medián přežití a celkový stav pacientů. Výsledky ukázaly, že u 19,8 % pacientů bylo dosaženo regrese a u 16 % pacientů stabilizace onemocnění. Pokud jde o délku přežití, 40 měsíců přežilo 60 % pacientů odpovídajících na léčbu, v porovnání s 10 % ve skupině pacientů, kteří nereagovali na léčbu. Rozdíl v přežití u pacientů, kteří odpovídali na léčbu, oproti skupině s progresí onemocnění, byl signifikantní. U 82,6 % pacientů došlo k významnému zlepšení celkového stavu, a to i u pacientů, u kterých onemocnění progredovalo. Léčba DFKB byla bez nežádoucích účinků, pouze v jednom případě se objevilo svědění.

V roce 2011 byla v časopise Current Pharmaceutical Biotechnology publikována další studie,12 která navazovala na zmíněnou studii z roku 2005. V této novější retrospektivní studii bylo hodnoceno 49 pacientů s hepatocelulárním karcinomem (HCC), kterým byly podávány DFKB. Ze 49 hodnocených pacientů mělo 38 hepatocelulární karcinom v pokročilém stádiu a 11 v terminálním stádiu. U 5 pacientů s HCC v pokročilém stádiu byla pozorována dlouhodobá kompletní odezva(13,1 %). Kompletní odezva (CR, complete response) byla definovaná jako dlouhodobé vymizení známek tumoru či jeho krevního zásobení na CT, s normalizací sérových hladin alfa-fetoproteinu (AFP). Těchto 5 pacientů přežívá bez známek onemocnění do současnosti (po dobu 26 až 53 měsíců). Zlepšení celkové výkonnosti (performance status) bylo dosaženo u 17 pacientů (34,6 %). Podávání DFKB nebylo spojeno s žádnými nežádoucími účinky. Prof. Biava s kolektivem recentně publikoval v časopise Current Medicinal Chemistry článek, který se zabývá možnostmi aplikace DFKB u dalších typů tumorů.13

Závěr


Prof. Biava uzavřel svoji přednášku shrnutím výsledků dosavadního výzkumu možností léčebné aplikace diferenciačních faktorů kmenových buněk (DFKB) u onkologických onemocnění. Experimentální data ukázala, že DFKB mají schopnost zastavit nebo zpomalit růst některých nádorových buněčných linií. Hlavní mechanismus účinku DFKB spočívá v tom, že přispívají k normalizaci funkce abnormálně proliferujících populací nádorových buněk prostřednictvím regulačních procesů, zahrnujících klíčové geny a proteiny buněčného cyklu. V rámci těchto zjištění je možno chápat nádorové buňky jako buňky kmenové, v kterých došlo k rozpojení diferenciačních a multiplikačních programů. Působení DFKB vede u některých typů nádorových buněk k jejich diferenciaci a zároveň k odstranění vlivu mutací, které by působily vznik maligního bujení, případně k apoptóze nádorových buněk. Dosavadní klinické studie ukázaly účinnost DFKB u hepatocelulárního karcinomu a zkoumají se další možnosti léčebného použití. Diferenciační faktory kmenových buněk představují novou perspektivu, která může přispět k rozšíření možností terapie onkologických onemocnění.

Literatura


1. Biava FM. A complex approach to cancer treatment: stem cell differentiation stage factors and their role in cancer cell reprogramming. Mezinárodní kongres FRM: medicína nízkých dávek, studie a kazuistiky. Abstracts. Praha, 2013:22-23.
2. Lakshmi MS, Sherbet GV. Embryonic and tumor cell interactions. Basel: Karger, 1974, 380-399.
3. Einhorn L. Are there factors preventing cancer development during embryonic life? Oncodev Biol Med 1982;4:219-229.
4. Pierce GB. The cancer cell and its control by the embryo. Am J Pathol 1983;113:116-124.
5. Yu CL, Tsai MH. Fetal fetuin selectively induces apoptosis in cancer cell lines and shows anti-cancer activity in tumor animal models. Cancer Letter 2001;166:173-184.
6. Kulesa PM, Kasermeier-Kulesa JC, Teddy JM, et al. Reprogramming metastatic tumor cells to assume a neural crest like phenotype in a embryonic microenvironment. Proc Nat Acad Sci USA 2006;103:3752-3757.
7. Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer and cancer stem cells. Nature 2001;414:105-111.
8. Biava PM, Bonsignorio D, Hoxa M. Cell proliferation curves of different human tumor lines after in vitro treatment with Zebrafish embryonic extracts. J Tumor Marker Oncol 2001;16:195-202.
9. Biava PM, Carluccio A. Activation of anti-oncogene p53 produced by embryonic extracts in vitro tumor cells. J Tumor Marker Oncol 1977;12:9-15.
10. Kim J, Lee SD, Chang B, et al. Enhanced antitumor aktivity of vitamin C via p53 in cancer cells. Free Radical Biology and Medicine 2012;53:1607–1615.
11. Livraghi T, Meloni F, Frosi A, Lazzaroni S, Bizarri TM, Frati L, Biava PM. Treatment with stem cell differentiation stage factors of intermediate-advanced hepatocellular carcinoma: an open randomized clinical trial. Oncol Res 2005;15:399-408.
12. Livraghi T, Ceriani R, Palmisano A, et al. Complete response in 5 out of 38 patients with advanced hepatocellular carcinoma treated with stem cell differentiation stage factors: case reports from a single centre. Curr Pharm Biotechnol 2011;12:254-60.
13. Biava PM, Niocolini A, Ferrari P, et al. Systemic approach to cancer treatment: tumor cell reprogramming focused on endocrine-related cancers. Curr Med Chem 2013 (Epub ahead of print). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24304275.


MUDr. Pavel Kostiuk, CSc.
Edukafarm, Praha

05.01.2015


Diskuse k článku Nová terapeutická perspektiva: diferenciační faktory kmenových buněk

Tato diskuse ještě neobsahuje žádné příspěvky.

Vložení nového příspěvku